Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie
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Sondes fluorescentes moléculaires et nanoparticules

Mise à jour 13 octobre 2015

Sondes fluorescentes moléculaires et nanoparticules

Nous développons des sondes fluorescentes fournissant des informations sur leur nano-environnement via une modification de leur couleur d’émission. Pour la construction de ces sondes, nous utilisons des synthons comme la 3-hydroxychromone (3HC), le Rouge Nil ou d’autres fluorophores sensibles à l’environnement. Les sondes 3HC subissent un Transfert Intramoléculaire de Proton à l’Etat Excité (ESIPT) qui génère deux états excités, normal (N*) et tautomère (T*), donnant lieu à une fluorescence duale. Le rapport des deux bandes d’émission N*/T* procure une information sur la polarité, l’hydratation et les champs électriques de l’environnement (1, 2). Le Rouge Nil ne présente qu’une seule bande d’émission dont le maximum est déplacé en fonction de la polarité de l’environnement.

Sondes Membranaires

Nous développons des sondes moléculaires répondant aux différentes propriétés des membranes lipidiques. La sélectivité de ces sondes vis-à-vis d’une propriété particulière peut être assurée par le choix approprié d’un fluorophore et de sa localisation dans la bicouche lipidique (3). Des exemples récents sont les sondes mesurant l’hydratation et la charge de surface (F2N12S) (4), les potentiels dipolaire (F8N1S et PPZ8) (5, 6) et transmembranaire (di-SFA) (7) et l’ordre lipidique (F2N12S and NR12S) (8,9).

Détection de l’apoptose

Les membranes de cellules saines présentent une forte asymétrie de composition de leurs deux feuillets, alors que cette asymétrie est perdue dans les cellules apoptotiques. La sonde F2N12S, qui s’incorpore sélectivement dans le feuillet externe de la membrane plasmique d’une cellule, peut détecter la perte de cette asymétrie grâce à une variation de son rapport d’intensité N*/T* (4). Etant ratiométrique, la réponse de cette sonde peut facilement être calibrée en microscopie de fluorescence, ce qui peut difficilement être réalisé avec des sondes fluorescentes basées sur l’Annexine-V. Récemment, nous avons montré que la sonde NR12S dérivée du Rouge Nil peut aussi être utilisée pour la détection de l’apoptose (10).

Imagerie des domaines membranaires

Il est admis que les domaines membranaires ou “radeaux lipidiques” sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires. Dans les modèles membranaires, ces domaines, définis comme des phases liquide-ordonnée, se comportent comme des radeaux flottant dans la phase fluide. Du fait de leur forte réponse à l’hydratation de la membrane, les sondes NR12S et F2N12S permettent de visualiser ces domaines dans des membranes modèles et de mesurer l’ordre lipidique dans les membranes cellulaires, par imagerie ratiométrique (8,9) et FLIM

Sondes pour interactions biomoléculaires

En utilisant des sondes sensibles à l’environnement, nous développons des stratégies pour suivre les interactions de peptides ou de protéines avec des acides nucléiques, des protéines ou des membranes lipidiques (11). L’interaction d’un peptide avec sa cible induit communément une modification de son environnement local pouvant être détectée par l’une de nos sondes via un changement de sa couleur d’émission.

Interactions Peptides-Acides nucléiques

Nous développons des sondes sensibles à l’environnement à partir de la 3HC afin d’étudier les interactions peptide-oligonucléotide (ODN). Ainsi, lorsque la sonde est fixée à l’extrémité N-terminale de la protéine NCp7 de VIH-1, son rapport N*/T* dépend de la séquence de l’ODN en interaction et corrèle avec la structure 3D du complexe correspondant (12). Nous avons étendu cette approche en développant des analogues d’acides aminés basés sur de la 3HC, capables de se substituer aux résidus Trp, permettant ainsi d’obtenir une information site-sélective sur ces complexes avec des ODNs (13). D’autres analogues d’acides aminés du même type sont en développement.

Interactions Peptides-Protéines

Le marquage d’un peptide par une sonde 3HC permet de suivre son interaction avec une protéine cible via les changements du rapport N*/T* (14), nous procurant ainsi un outil universel pour étudier les interactions peptide-protéine (11).

Interactions Protéines-Membranes

Nous avons également développé des sondes et des analogues d’acides aminés dérivés des 3HC pour suivre des interactions protéine-membrane (15). Actuellement, nous les utilisons pour étudier l’insertion et l’orientation de différents peptides (mélittine, NCp7, penétratine…) dans des membranes modèles et/ou cellulaires

Nanoparticules fluorescentes et vecteurs

Nanoparticules fluorescentes organiques.

Les nanoparticules fluorescentes ont révolutionné le domaine de l’imagerie en biologie de par leur brillance exceptionnelle et la possibilité des utiliser en combinaison avec d’autres modalités en imagerie et en thérapie. Les nanoparticules les mieux caractérisées à ce jour sont des nanoparticules inorganiques telles que les quantum dots ou les nanoparticules de silice dopées avec une sonde. Cependant, leur principale limitation réside dans leur faible biodégradabilité. Notre but est de développer des nanoparticules fluorescentes organiques de taille contrôlée (5 to 100 nm), biodégradables et présentant une brillance comparable, voir meilleure, à celle des quantum dots. Ces nanoparticules sont obtenues par auto-assemblage de lipides (16), d’amphiphiles (17), ou de polymères, et sont capables de répondre par des changements de leurs propriétés photophysiques à des stimuli externes. Elles sont destinées à être appliquées pour la détection sensible de biomolécules (enzymes ou acides nucléiques) et pour l’imagerie cellulaire ou du petit animal, notamment dans le contexte de pathologies virales ou cancéreuses.

Vecteurs supramoléculaires pour oligonucléotides et peptides

Nous développons aussi de nouveaux concepts en vue de préparer des nano-vecteurs pour peptides et acides nucléiques. Notre équipe a été pionnière dans l’utilisation des techniques de spectroscopie et microscopie de fluorescence pour des études de délivrance de gènes avec des vecteurs à base de lipides cationiques (18,19) et de polymères (20,21). Récemment, nous avons développé nos propres stratégies pour concevoir et synthétiser des vecteurs. Des bolaamphiphiles asymétriques ont été conçus pour former avec l’ADN des nanostructures capables de transfecter des cellules in vitro (22,23). Des calixarénes cationiques amphiphiles ont également été conçus pour former des micelles s’assemblant avec l’ADN en nanoparticules stables avec un bon pouvoir transfectant (24). Actuellement, nous étendons ces approches au développement de nano-vecteurs pour de courts oligonucléotides et peptides. Une modalité de fluorescence a également été introduite pour des applications théranostiques.