Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie
UMR CNRS 7213


Partenaires

CNRS
Logo Universite de strasbourg
 

Rechercher

Sur ce site

Sur le Web du CNRS


Accueil du site > Equipe Biophotonique des interactio > Physique et chimie pour l’imagerie > Microscopie de fluorescence (...)

Instrumentation de pointe en spectroscopie et microscopie de fluorescence

P. Didier, L. Richert

Mise à jour 30 avril 2013

Parmi nos activités de recherche, nous développons et utilisons une instrumentation de pointe en spectroscopie et microscopie de fluorescence :

- Imagerie biphotonique quantitative
- Microscopie à Molécule Unique
- Imagerie à haute résolution
- Mesures de fluorescence résolue en temps
- Microscopie à Force Atomique
- Synthèse Peptidique

Imagerie biophotonique quantitative

Nous avons construit un microscope à excitation biphotonique combinant une imagerie à deux photons avec des modalités d’imagerie quantitative telles le FLIM et la FCS

L’imagerie biphotonique offre de nombreux avantages comparés à la microscopie confocale, notamment en induisant moins de photo-dommages et en permettant une imagerie sur des échantillons plus épais (du fait d’une meilleure pénétration de la lumière IR par rapport à la lumière visible)

Microscopie d’Imagerie en Temps de Vie de Fluorescence (FLIM)

Le FLIM est une technique consistant à mesurer les temps de vie de fluorescence d’un fluorophore pour chaque pixel de l’image. En utilisant le principe du Transfert Résonnant d’Energie de Fluorescence (FRET), les interactions protéine-protéine (l’une marquée par un donneur d’énergie de fluorescence et l’autre par un accepteur) peuvent être résolues spatialement en mesurant le temps de vie de fluorescence du donneur. Le principal avantage de cette technique découle du fait que le temps de vie de fluorescence est un paramètre intrinsèque qui ne dépend pas de la concentration en donneur et de la puissance d’excitation du laser.

Spectroscopie par Corrélation de Fluorescence (FCS)

La FCS est une technique basée sur l’analyse des fluctuations d’intensité d’espèces fluorescentes diffusant à l’intérieur d’un volume de l’ordre du femtolitre (défini par le laser d’excitation). La constante de diffusion, la concentration locale et la brillance de chacune de ces espèces, étant reliées à leurs propriétés photophysiques et hydrodynamiques, peuvent ainsi être déterminées.

JPEG - 23.5 ko

FCS à deux foyers

Pour déterminer avec une grande précision les coefficients de diffusion des espèces fluorescentes, un dispositif FCS à deux foyers à été construit, en utilisant un interféromètre de Michelson. La distance précise entre les deux foyers permet de surmonter les incertitudes sur la taille et de la forme du volume confocal, existant en FCS à un seul foyer.

JPEG - 26.2 ko

FCS à balayage (sFCS)

En sFCS, le signal de fluorescence est collecté en balayant le faisceau laser sur l’échantillon. Dans ce cas, les fluctuations de fluorescence contiennent à la fois des informations spatiales et temporelles sur les espèces fluorescentes. Différents modes de sFCS sont disponibles selon les paramètres requis (FCS circulaire, RICS, N&B). Les techniques de sFCS sont particulièrement adaptées pour des espèces à diffusion lente.

JPEG - 37.9 ko

[top Page]

Microscopie à molécule unique

La microscopie à molécule unique fournit des informations individuelles sur des populations hétérogènes de molécules en permettant l’accès à la distribution complète des observables. Elle permet ainsi de discriminer entre une hétérogénéité de nature statique ou dynamique et de détecter des événements rares, masqués soit par un effet de moyenne sur l’ensemble des molécules soit par l’impossibilité de synchroniser les molécules. Nous avons construit un dispositif composé d’un microscope à champ large avec illumination TIRF (Fluorescence à Réflexion Totale Interne) couplé à une EMCCD, capable d’imager des molécules uniques.

JPEG - 33 ko

[top Page]Imagerie à haute résolution

Jusqu’à récemment, la microscopie optique ne pouvait aller en deçà de la limite imposée par la diffraction, soit 200 nm dans la direction latérale et 500 nm dans la direction axiale. Des avancées récentes ont permis de franchir ces limites, initiant l’ère extrêmement prometteuse de la “nanoscopie”, avec une résolution inférieure à 50 nm. Parmi les différentes techniques de nanoscopie, nous avons développé deux montages basés respectivement sur une microscopie à champ large et une autre à balayage, permettant d’imager des objets avec une résolution de 40 nm.

PALM/STORM

Dans la microscopie de localisation par photoactivation (PALM) et la microscopie par reconstruction stochastique optique (STORM), quelques molécules sont activées, imagées, puis éteintes ou photoblanchies. Une image en deçà de la limite de diffraction est alors reconstruite après avoir déterminé avec une haute précision la position de toutes les molécules individuelles.

STED

Dans la technique de microscopie de déplétion par émission stimulée (STED), la fonction d’étalement du point (PSF) est physiquement réduite par un laser de déplétion de forme annulaire qui éteint les fluorophores à la périphérie du spot d’excitation.

[top Page]

Mesures de fluorescence résolue en temps

Nous avons développé un dispositif, basé sur le comptage de photons uniques (Time-Correlated Single Photon Counting), équipé d’une source d’excitation laser picoseconde et d’un photomultiplicateur à galette de microcanaux. Le dispositif permet la mesure de temps de vie de fluorescence et de temps de corrélation rotationnelle, avec une résolution temporelle de 30 ps.

Les déclins d’intensité résolus en temps permettent d’obtenir une information détaillée sur l’environnement des fluorophores ainsi que sur leurs conformations et leurs réactions à l’état excité. Ces déclins sont aussi idéalement adaptés pour suivre les processus de transfert d’énergie par résonance et d’inhibition dynamique de la fluorescence. Les déclins d’anisotropie résolus en temps sont utiles pour étudier et distinguer les rotations locales et globales (taille-dépendantes) de biomolécules marquées.

[top Page]

Microscopie à Force Atomique

Le Laboratoire est équipé d’un microscope commercial à sonde de balayage (NT-MDT solver PRO) qui permet des mesures d’AFM en phases sèche ou liquide. Un module spécifique est aussi disponible pour de la microscopie de balayage à effet tunnel (STM). Un deuxième montage combinant une AFM avec un microscope TIRF a été développé. L’AFM permet de travailler en phase sèche ou liquide, avec un mode contact ou intermittent. La superposition et l’analyse des images AFM et de fluorescence se fait post-acquisition. Des modes STORM et SFT (suivi de fluorophores uniques) sont également disponibles.

Synthèse Peptidique

Un synthétiseur ABI 433 (Applied Biosystem) est utilisé pour réaliser la synthèse de peptides en phase solide par la méthode Fmoc. La taille du peptide et sa quantité dépendent du type de résine utilisé. Des peptides de 20 à 96 acides aminés ont été synthétisés (NCp7, Vpr et Tat de HIV-1, protéine core de HCV …) (12,13). Le marquage avec des acides aminés non-naturels et des fluorophores commerciaux (fluorescéine, rhodamine….) ou synthétisés au laboratoire (dérivés 3-hydroxychromone) peut être réalisé.