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Interactions Biomoléculaires : Protéine de la Nucléocapside de VIH-1

Yves Mély et Hugues de Rocquigny

Mise à jour 15 avril 2013

La protéine de la nucléocapside du VIH-1, NCp7, est une petite protéine basique, caractérisée par deux doigts de zinc, qui joue un rôle clef dans le cycle vital de VIH-1 et de ce fait constitue une cible intéressante pour une thérapie antivirale. Un axe majeur de recherche de notre équipe repose sur la caractérisation de la structure, des propriétés et des fonctions de cette protéine.

Mécanisme des propriétés chaperonnes de NCp7 vis-à-vis des acides nucléiques.

Par ses propriétés chaperonnes, la NCp7 reconfigure les acides nucléiques dans leur conformation la plus stable. Nous caractérisons au niveau moléculaire les mécanismes de ces propriétés chaperonnes de NCp7, en particulier lors des deux sauts de brin obligatoires dans la transcription inverse.

Nous avons montré que NCp7 chaperonne le premier saut de brin en favorisant l’hybridation des séquences tige-boucle complémentaires TAR RNA et cTAR DNA. Ceci repose de manière critique sur la capacité de NCp7 à reconnaître préférentiellement des guanines non appariées montrant un fort degré de mobilité (1) et de transitoirement fusionner les paires de bases terminales (2–5). Cette activité de déstabilisation est conditionnée par le plateau hydrophobe à la surface des doigts de zinc de la NCp7 qui restreint la flexibilité de l’oligonucléotide et la dynamique locale des bases (6, 7). Plus spécifiquement, NCp7 déstabilise l’avant-dernier segment double-brin de la tige de cTAR, via une liaison doigt de zinc-dépendante de NCp7 à deux résidus guanine (8). NCp7 modifie également le mécanisme d’hybridation de (+)/(-)PBS lors du second saut de brin en activant une voie boucle-boucle, négligeable en l’absence de NCp7 (9, 10). Cette commutation de l’hybridation de (+)/(-)PBS dirigée par NCp7 est due à une restriction de la dynamique locale des séquences ADN, qui s’avère critique pour la spécificité et la fidélité du second saut de brin (11). En outre, nous avons trouvé que les polarités de liaison inversées de NCp7 pour les séquences ARN et ADN sont conditionnées par l’interaction de NCp7 avec les sucres (12). Actuellement, nous complétons cette caractérisation du mécanisme de NCp7, afin de trouver de nouvelles pistes pour inhiber l’activité de NCp7 lors la transcription réverse. De plus, nous étudions en parallèle les propriétés chaperonnes de Tat, afin de mieux comprendre leur mécanisme et leur rôle dans le cycle viral (13, 14).

Interaction de NCp7 avec les protéines virales et de l’hôte

Bien qu’une grande partie des fonctions ubiquitaires de NCp7 repose sur ses interactions avec les acides nucléiques, il devient de plus en plus évident que des interactions de NCp7 avec d’autres protéines de VIH-1 ainsi qu’avec des protéines de l’hôte jouent également un rôle clef. Notre objectif est de caractériser ces interactions et d’identifier leurs fonctions dans le cycle viral.

Un de nos objectifs est de déterminer comment NCp7 coopère avec la transcriptase inverse (RT) lors de la transcription inverse. Nous avons montré que NCp7 accroît la stabilité des complexes RT-substrat en réduisant leurs constantes de dissociation (15). Ainsi, non seulement NCp7 participe indirectement à la transcription inverse par son activité chaperonne, mais aussi en agissant directement sur la réaction d’incorporation d’un nucléotide, probablement par le biais d’une interaction avec la RT. Nous poursuivons ces recherches sur les mécanismes moléculaires de NCp7 en tant qu’assistant de la RT, par des techniques en molécule unique.

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Gag assembly by FLIM (A) and interaction with a cell protein (B) by confocal microscopy

En outre, nous recherchons des partenaires cellulaires susceptibles d’interagir avec NCp7 lors des différentes étapes du cycle viral. Notre objectif est d’identifier ces partenaires, de démontrer leur interaction avec NCp7, par des techniques biochimiques et d’imagerie, et de décrire le rôle de ces interactions dans le cycle viral. Nous caractérisons aussi le rôle du domaine NCp7 de la polyprotéine Gag lors de l’assemblage des particules virales.

Molécules bioactives dirigées contre NCp7

De part son haut degré de conservation et son rôle crucial dans plusieurs étapes du cycle viral, NCp7 apparaît être une cible idéale pour une thérapie anti VIH-1, avec l’espoir d’inhiber des étapes multiples de la réplication du VIH-1 ceci à l’aide d’un unique composé qui ne générerait que peu ou pas de résistance (16, 17). Sur la base des propriétés chaperonnes de NCp7, nous avons développé plusieurs classes de molécules capables d’inhiber NCp7 et ainsi, le cycle viral.

Petites molécules. Par criblage virtuel, deux molécules capables de se lier aux doigts de zinc de NCp7, et montrant une activité antirétrovirale à des concentrations micromolaires ont été identifiées (18). En outre, le criblage d’une chimiothéque par un test reposant sur les propriétés chaperonnes de NCp7 nous a permis d’identifier des touches inhibant NCp7, sans éjection du zinc (19). Notre objectif est de cribler davantage de molécules afin de découvrir des composés présentant une meilleure efficacité. Par un autre criblage, le composé N,N’-bis(1,2,3-thiadiazol-5-yl)benzene-1,2-diamine (NV038) a été identifié comme bloquant efficacement un large spectre de lignées VIH et VIS (20). NV038 agit lors de la transcription inverse, en éjectant le zinc de NCp7 par un mécanisme original. Nous avons également identifié la 2-methyl-3-phenyl-2H-[1,2,4]thiadiazol-5-ylideneamine (WDO-217) capable d’éjecter le zinc de NCp7, même lorsque cette dernière est liée à des acides nucléiques (21). WDO-217 inhibe les infections d’un large spectre de souches VIH-1, sauvages ou résistantes.

Oligonucléotides dirigés contre NCp7 De petits oligoribonucléotides méthylés (mODN) inhibant efficacement les propriétés chaperonnes de NCp7 et empêchant, à concentration nanomolaire, la réplication du VIH-1 dans des cellules primaires humaines ont été développés (22). Ces mODNs réduisent fortement la synthèse virale du cDNA, en se liant à forte affinité à la plate-forme hydrophobe de NCp7 (23). Ainsi, en séquestrant NCp7, les mODNs empêchent cette dernière d’exercer son activité chaperonne sur l’ADN viral, pendant la transcription inverse.

Peptides Des hexapeptides riches en Trp ont été identifiés par la technique du « phage display ». Nous avons montré que ces peptides se lient aux séquences TAR et PBS avec des affinités comparables à celles de NCp7 et inhibent fortement l’activité déstabilisatrice de NCp7 (24). Ces peptides montrent des activités antivirales à des concentrations micromolaires (25). Des inhibitions plus importantes des propriétés chaperonnes de NCp7 ont été obtenues avec une seconde génération de peptides, actuellement en cours d’étude.

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